Thiết lập và tối ưu hóa quy trình realtime PCR phát hiện DIV1

Công cụ hữu hiệu

Theo Trương Đình Hoài và cộng sự (2024), Decapod Iridescent Virus 1 (DIV1) được phát hiện lần đầu tiên vào đầu năm 2014 trên tôm càng đỏ (Cherax quadricarinatus) tại tỉnh Phúc Kiến (Fujian) của Trung Quốc (Xu et al., 2016). Sau đó DIV1 được xác định là nguyên nhân gây chết hàng loạt TTCT ở một số tỉnh ven biển của Trung Quốc. Kết quả giám sát trong năm 2017 – 2018 đã phát hiện được DIV 1 ở 11 trong số 16 tỉnh của Trung Quốc. Năm 2019, bệnh do DIV1 xảy ra nghiêm trọng ở toàn bộ lưu vực Đồng bằng Châu Giang. Tháng 2/2020 bệnh xuất hiện trở lại ở tỉnh ở Quảng Đông, thủ phủ nuôi tôm ở Trung Quốc, ảnh hưởng đến 25% diện tích tôm nuôi trong vùng (NACA, 2020). Tháng 7/2020, DIV1 đã phát hiện được ở càng tôm đỏ, TTCT và tôm sú nuôi tại Đài Loan (OIE, 2020b).

Dấu hiệu tôm khỏe (health) và tôm bị nhiễm DIV1 (DIV1 – infected). Ảnh: TB

Các loài tôm mẫn cảm với virus DIV1 bao gồm tôm nước lợ, nước mặn và tôm nước ngọt như TTCT (Litopenaeus vannamei), tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), tôm càng đỏ (Cherax quadricarinatus), tôm hùm nước ngọt hay tôm hùm đất (Procambarus clarkia), tôm càng sông (Macrobrachium nipponense) và tôm gai (Exopalaemon canrinicauda), tôm sú (Penaeus monodon), TTCT Nhật Bản (Panulirus japonicus) (Chen et al., 2019; OIE., 2020a; Qiu et all., 2023).

Một số nước nuôi tôm phát triển hoặc nhập khẩu nhiều tôm quy định phải có kiểm dịch DIV1 âm tính ở tôm nhập khẩu (Hàn Quốc, Australia, New Zealand) (Biosecurity New Zealand, 2022) và một số bang ở Mỹ yêu cầu tôm vận chuyển nội địa phải có chứng nhận DIV1 âm tính (USAD, 2022). Mạng lưới Trung tâm Nuôi trồng thủy sản châu Á Thái Bình Dương (NACA) và Tổ chức Thú y thế giới (OIE- WOAH) đã xếp bệnh do DIV1 trong danh mục bệnh truyền nhiễm phải báo cáo (NACA, 2019, WOAH, 2022). Theo khuyến cáo của NACA, ở cấp khu vực và quốc gia cần tăng cường năng lực cho việc xây dựng quy trình chẩn đoán, xét nghiệm virus DIV1 và đây là công cụ hữu hiệu để giám sát, kiểm dịch tôm giống và phát hiện sớm dịch bệnh (NACA, 2020). Từ thông tin về tình hình dịch bệnh do virus DIV1 trên tôm từ Trung Quốc, OIE và NACA khuyến cáo các nước trong khu vực về nguy cơ xâm nhiễm của DIV1.

Một trong những khó khăn đối với nhóm đó là khả năng tiếp cận mẫu dương tính, vì hiện chưa có báo cáo nào về bệnh DIV1 ở Việt Nam. Việc đưa mẫu virus dương tính vào để nghiên cứu, xây dựng quy trình xét nghiệm ở Việt Nam có thể tiềm ẩn nguy cơ lây lan mầm bệnh. Do vậy, các nhà khoa học cho rằng quy trình xét nghiệm bằng realtime PCR sử dụng plasmid chứa đoạn gen đích của virus DIV1 là biện pháp tối ưu nhất hiện nay.

Kết quả

Theo nhóm tác giả, kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình realtime PCR ở nồng độ mồi dò 0,2 µM cho khả năng phát hiện tối ưu nhất. Giới hạn phát hiện của phản ứng lần lượt là 13,6 và 14,3 bản sao plasmid/phản ứng, hiệu suất lần lượt là 98,9% và 92,6%. Phản ứng có độ đặc hiệu cao (không có phản ứng với các mẫu tôm dương tính với WSSV, IHHNV, AHPND, EHP) và ổn định (CV < 15%). Từ kết quả trên có thể kết luận, hai quy trình realtime PCR sử dụng plasmid chứa gen MCP và ATPase đã được thiết lập và tối ưu hóa trong nghiên cứu này đảm bảo độ tin cậy và có thể ứng dụng để tầm soát và kiểm soát bệnh DIV1 cho các phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

DIV1 tấn công vào tế bào máu trong mang, gan tụy và cơ của tôm. Khi tôm bị nhiễm DIV1, tôm chìm xuống đáy ao, mềm vỏ và chuyển màu đỏ nhạt, dạ dày và ruột rỗng, bề mặt và mặt cắt gan tụy nhạt màu.

Lê Loan